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Biotechnologie und Molekulare Genetik



DNA-Markierung mittels Psoralen-Biotin

Im Gegensatz zu den gängigen, aber kostenintensiven Markierungen über "Random-primed Labelling" oder Nick-Translation wurde im Rahmen des Projekts eine Markierungsmethode etabliert, die auf der kovalenten Kopplung von Psoralen-Biotin an die zu markierende DNA basiert. Nach der Denaturierung der Proben-DNA erfolgt eine kovalente Anbindung von Psoralen-Biotin durch UV-Crosslinking und die Hybridisierung dieses Komplexes an die Fänger-Sonden auf der Chip-Oberfläche. Im anschließenden Farbdetektionsschritt wird ein Streptavidin-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugat (STV-Cy5) an das Biotin der hybridisierten Proben-DNA gebunden.



Für den Hybridisierungsnachweis wird der Chip in einem Fluoreszenz-Scanner ausgewertet, der die Signale den Sondenpositionen zuordnet. Es lässt sich eine Aussage über die An- oder Abwesenheit des untersuchten genetischen Markers im Probenmaterial treffen. So können pathogene Bakterien im Produkt ausgeschlossen werden oder eine Starterkultur hinsichtlich ihres Phagenresistenzgenspektrums untersucht werden.

Die im Rahmen des DBU-Projekts neu etablierte Methode zur direkten Fluoreszenz-Markierung von genomischer DNA basiert auf der kovalenten Anbindung von Psoralen-Biotin an die DNA durch UV-Crosslinking und der Detektion nach Zugabe von Streptavidin- Cy5. Durch diese im Vergleich zum Labeling über Nick-Translation oder "random primed labeling" kostengünstigere Methode ist es nun beispielsweise möglich, die DNA von humanpathogenen Bakterien wie Salmonellen oder Listerien direkt, ohne Amplifizierung in der PCR-Reaktion, nachzuweisen.



 


This page was last updated in November 2004 by Christiane Glöckner